摘要
猪繁殖与呼吸综合症病毒 (PRRSV) 即蓝耳病病毒，是一个对全球养猪业有显著经济影响的病原体。替米考星是从Tylosin B所研发的新型半合成大环内酯类抗生素。替米考星可以进入肺泡巨噬细胞 (PAMs) 并抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒在肺泡巨噬细胞体外复制。为评估替米考星对于控制猪体内的繁殖与呼吸综合症病毒复制的影响而进行本研究。
我们从台湾和大陆受 PRRSV 感染的一贯化猪场中分别随机挑选了40只和635只未断奶的幼猪。幼猪平均分成两组，并饲育在相同的猪圈，但分隔为个别的饲养空间。断奶后持续给予替米考星 (泰美妙 ® 20% 预混剂, 400 mg/kg) 21天（治疗组）。未治疗组的幼猪未接受替米考星。
在年龄届第4,6,8,10和12周时采集血液样本，以侦测 PRRSV 含量。在8周和10周龄时，比较在台湾接受替米考星治疗的幼猪与未接受治疗的幼猪，接受替米考星治疗的幼猪的PRRSV 量显著下降 (P<0.05)。在6,8,10和12周龄时，比较在大陆接受替米考星治疗的幼猪与未接受治疗的幼猪，接受替米考星治疗的幼猪的PRRSV 量显著下降 (P<0.05)。这些数据表明接受替米考星治疗的动物不仅有较低的 PRRSV 含量，它们研究期间的日均增重也有所改善。
关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒、病毒量、替米考星、体内测试
1.引言
猪繁殖与呼吸综合症 (PRRS) 是一种重要的猪病，它对大部分产猪国家造成重大的经济损失 (Zimmermanet al., 2012)。20世纪90年代初病毒学家确定了致病原为猪繁殖与呼吸综合症病毒 (PRRSV) 。虽然PRRSV已被确认为猪繁殖与呼吸综合症的致病原超过20年，但目前的管理策略主要集中在通过接种疫苗预防 PRRSV 感染(Murtaugh & Genzow,2011)。然而现有的减毒活疫苗不足以根除病毒，且不能为免受感染提供完全免疫 (Murtaugh & Genzow,2011)。
在我们过往的研究中，高PRRSV含量的猪只（血清内﹥10 4.2 PRRSV genomes/µl）似乎显示高病毒量与PRDC的存在相关 (Lin,Lin,Hung,Wang,& Chiou, 2013)。这些数据表明减低血清内的PRRSV含量也许可能预防猪只感染PRRSV后产生临床病征。许多研究试图找出体外和体内有效对抗PRRSV的治疗方法，至今市面上仍没有有效的药物可以预防猪只体内 PRRSV感染。
替米考星是从tylosin B 所研发的新型半合成大环内酯类抗生素 (Scorneaux & Shryock,1998)，且针对革兰氏阳性和部分革兰氏阴性细菌是一种有效的抗微生物制剂 。一个近期研究显示替米考星在培养的猪肺泡巨噬细胞中对猪繁殖与呼吸综合症病毒复制呈现剂量强烈的抗病毒效果，有剂量依赖的现象 (Du et al., 2011)。实验中感染PRRSV的猪只以替米考星（放入饲料添加剂）治疗，与未接受治疗的感染对照组相比，结果显示获替米考星的猪只，他们在淋巴结肥大、肺病变和病毒血症等方面的严重度下降 (Benfield et al., 2002)。此外，使用体外和体内服用替米考星模式系统证明此抗生素具有强效免疫调节和抗发炎效果(Buret,2010;Cao et al.,2006;Ci,Chu,Xiang,Li,&Deng,2011)。
根据替米考星的抗病毒活性，我们推测在自然感染的猪只中，替米考星可作为PRRSV的抗病毒剂。因此，本研究的目的是评估替米考星对于控制体内猪繁殖与呼吸综合症病毒复制的影响。
2.方法
2.1 动物和标本采集以及样本制备
40只四周龄和635只三周龄未断奶的幼猪，分别从台湾和大陆受 PRRSV 感染的一贯化猪场中随机挑选。两群猪显示多数保育猪在6- 8周龄时易受PRRSV感染（未显示数据）。幼猪随机平均分成两组，并饲育在相同的猪圈，但分隔为个别的空间。实验期间猪只可自由摄食及饮水。治疗组的幼猪断奶后开始连续3周以替米考星(2 mg/kg,泰美妙® 20%预混剂,比利时浩卫制药股份有限公司)饲育。
未治疗组的幼猪与治疗组接受相同饲育方法，但饲料中没有加入替米考星，作为对照组。台湾的实验中，所有幼猪在4周龄和12周龄时进行称重。台湾与大陆实验于4,6,8,10和12周龄采集猪只血液样本。血清经过分离并储存于-80°C的温度，供后续病毒 RNA 测定用。
2.2 实时聚合酶连锁反应(Real-Time PCR)(试剂盒及实验步骤略)
所有来自台湾和大陆的样本，分别在台湾国立屏东科技大学和大陆华南农业大学进行分析。
2.3 ELISA
在台湾实验中，针对治疗组与未治疗组的幼猪，在4,6,8,10和12周龄时采集猪只血液样本，根据制造商说明，使用 HerdChek PRRS X3 病毒抗体检测试剂盒 (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME, USA)，侦测特定抗PRRSV抗体。假如ELISA样本阳转率 (S/P) 低于0.4，则被认定抗PRRSV抗体不存在。
2.4 统计分析
使用学生t-检定比较治疗组与未治疗组之间，不同时间点的病毒量。使用卡方检定 (Chi-square Test) 评估治疗组和未治疗组之间存活率的差异。P 值 < 0.05 和 < 0.001 分别视为显著与高度显著。
3.结果
3.1 PRRSV 检出率
台湾实验期间（4到12周龄），我们使用未治疗组与治疗组采集的血清进行PRRSV存在检测。如实时聚合酶连锁反应测定，在台湾，未治疗组的93个样本中，有31个(33.3%) 呈现阳性反应，而治疗组的96个样本中有30个(31.3%) 呈现阳性反应（表 1）。我们计算了未治疗组与治疗组之间 PRRSV检出率的相关性。在两个实验之间进行分析，每个时间点针对PRRSV的阳性结果并未显示与替米考星治疗有显著相关（表 1）。
3.2 不同时间点PRRSV量的评估
不同时间点PRRSV量的评估显示台湾样本中，未治疗组的PRRSV量(范围从1.96至5.19 log10 PRRSVgenomes/µl, 平均值3.17 log10）显著高于(P = 0.0003) 治疗组(范围从 1.25至3.73 log10 PRRSV genomes/µl,平均值2.50 log 10）（表 1）。在大陆实验的样本中我们也观察到相似结果，未治疗组的PRRSV量 (范围从0.15至5.84 log 10 PRRSV genomes/µl, 平均值2.66 log 10 }）显著高于 (P = 6.86E-07) 治疗组(范围从0.86至3.95 log 10 PRRSV genomes/µl, 平均值 2.11 log 10 ）（表 1）。测试期间在所有时间点两组的样本都侦测到PRRSV病毒血症，除了4周龄以外（台湾实验的所有样本均呈阴性），治疗组每个时间点的平均PRRSV 核酸复制量均低于未治疗组，台湾组在8周龄 (P = 0.027) 与10周龄 (P = 0.007)时观察到显著差异（图 1）。在大陆进行的实验也获得相似结果，4周龄除外。治疗组在每个时间点的平均 PRRSV 核酸复制量均低于未治疗组，在6周龄 (P = 0.014)、8周龄 (P = 0.006)、10周龄 (P = 0.006) 与 12周龄 (P = 0.001)观察到显著差异（图 2），接受替米考星治疗的幼猪，其于不同时间点的最大和最小复制量始终低于未接受治疗的幼猪（图 1 和图 2）。
3.3 台湾实验中 PRRSV 抗体的测量
ELISA结果显示，两组幼猪在6周龄时有最低的 S/P 比，从8到12周龄后持续增加。两组之间的差异未有统计意义（图 3）。
3.4 台湾实验中日增重评估
为了评估两组中给予替米考星对日均增重的影响，所有幼猪在4周龄与12周龄时进行秤重。治疗组和未治疗组日均增重分别为0.45±0.13kg和0.48±0.08 kg（表 2）。治疗组幼猪的日均增重些微高于未治疗组，但两组之间不存在统计差异。

表 1. 台湾和大陆未治疗组与治疗组所采集的血清中，PRRSV量结果的数目和概述

注释：1) 每微升血清中Log 10 复制量；** 未治疗组与治疗组之间存在高度显著差异。

表 2. 在 4 周龄与 12 周龄时，两组猪只日均增重 (ADWG) 和平均体重

注释： 1) 表中所显示的数据单位为公斤； 2) 数据以平均值 ± 标准偏差（数字）显示。
4.讨论
现有的减毒活疫苗不足以根除病毒，且未提供完全免受感染的免疫力 (Murtaugh & Genzow, 2011)。因此，有效的辅助策略应包含抗病毒药物以及免疫调节治疗。评估替米考星对抗 PRRSV 抗病毒效果时，我们的数据显示替米考星能有效降低体内 PRRSV 量。替米考星是从tylosin B所研发的新型半合成大环内酯类抗生素，具有强效免疫调节和抗发炎作用 (Buret, 2010; Cao et al., 2006; Ci et al., 2011)。替米考星被研发作为猪只预混饲料配方的动物用药，且被视为能有效对抗几种猪呼吸病原体的药物 (DeRosa et al., 2000; Fittipaldi et al., 2005;Shryock et al., 2002; Thacker et al., 2001)。
Benfieldet al. (2002) 指出替米考星可以降低实验中感染PRRSV猪只的淋巴结肥大、肺病变和病毒血症等方面的严重度。本研究是首个证实在台湾和大陆自然感染的猪只中，替米考星能降低血清中PRRSV量的研究。
先前研究中，学者曾提议血清 10 4.2 PRRSV genomes/µl作为猪只有PRDC的阈值 (Lin et al., 2013)。与未治疗组相比，以替米考星治疗的幼猪，它们在每个时间点的PRRSV病毒血症发生率都有所下降。有趣的是，治疗组的幼猪没有一只任何一只幼猪血清中病毒量达到10 4.2PRRSV genomes/µl（图 1 和图 2）。这些数据表示替米考星可能可以防止自然感染PRRSV的猪只罹患PRDC。
总括而言，我们证实了无论单独使用替米考星还是与其它疫苗模型结合均可在受感染的动物中显著降低病毒血症，进而提升受PRRSV感染猪只的日均增重。
作者：Chao-Nan Lin,Yu-Jian Yyang,Wei-Hao Lin,Hsien-Ching Wu,Zhixuan Xiong,Wouter Depondt,Alain Kanora,Min Cui,Danping Su,DongSheng He & Ming-Tang Chiou.

                                               李永涛